Úvod
Fixácia na báze paraformaldehydu je široko používaná metóda v bunkovej biológii a pracovných postupoch súvisiacich s mikroskopiou na zachovanie bunkovej morfológie a stabilizáciu biomolekulových štruktúr. Výskumníci bežne používajú fixačné roztoky odvodené od paraformaldehydu na prípravu vzoriek na imunofarbenie, fluorescenčnú mikroskopiu a súvisiace laboratórne analytické techniky.
Častou otázkou, ktorá vzniká, je: aký je optimálny čas fixácie? Odpoveď však nie je jednoznačná. Čas fixácie nie je možné zvoliť nezávisle od charakteristík vzorky, formulácie fixácie, teploty a následných analytických požiadaviek. To, čo funguje pre jeden typ buniek alebo test, môže priniesť zlé výsledky v inom.
Tento článok vysvetľuje, prečo neexistuje univerzálny čas fixácie paraformaldehydu a načrtáva kľúčové faktory, ktoré ovplyvňujú podmienky fixácie. Poskytuje tiež usmernenie o tom, čo by si mali kupujúci a používatelia v laboratóriu overiť pri výbere paraformaldehydových produktov na fixačné aplikácie.
Ako funguje fixácia na báze paraformaldehydu
Paraformaldehydje pevný polymér formaldehydu. Bežne sa používa na prípravu vodných fixačných roztokov formaldehydu. V roztoku paraformaldehyd depolymerizuje a uvoľňuje formaldehyd, ktorý je aktívnym sieťovacím činidlom.
Formaldehyd reaguje s amínovými skupinami na proteínoch za vzniku metylolových aduktov, ktoré môžu ďalej reagovať so susednými nukleofilnými skupinami za vzniku metylénových priečnych väzieb. Tieto zosieťovacie reakcie pomáhajú zachovať bunkovú morfológiu a stabilizovať biomolekulové štruktúry imobilizáciou proteínov a iných makromolekúl v ich bunkovom kontexte.
Chémia fixácie formaldehydu je zložitá a závisí od viacerých premenných, vrátane pH, teploty a chemického prostredia cieľových molekúl. Podmienky fixácie musia byť preto starostlivo prispôsobené vzorke a zamýšľanej následnej analýze.
Prečo sa doba fixácie líši
Typ a hrúbka vzorky
Požiadavky na fixáciu sa medzi rôznymi typmi vzoriek značne líšia. Kultivované adherentné bunky, bunky v suspenzii a tkanivové rezy predstavujú rôzne výzvy pre fixačnú penetráciu a zosieťovanie.
Hrúbka vzorky a dostupnosť priamo ovplyvňujú, ako rýchlo sa fixátor dostane do všetkých oblastí vzorky. Podmienky validované pre kultivované bunky by sa nemali automaticky aplikovať na hrubšie vzorky tkaniva. Fixácia tkaniva vyžaduje protokoly špecifické pre vzorku, pretože požiadavky na fixáciu silne závisia od typu tkaniva, veľkosti, hrúbky, metódy fixácie a následnej analýzy.
Fixačná koncentrácia a zloženie
Fixačná koncentrácia je dôležitou premennou pri fixácii na báze paraformaldehydu. Koncentrácia a expozičný čas však interagujú s inými faktormi, ako je teplota, priepustnosť vzorky a zloženie pufra. Tieto premenné by sa mali vyhodnocovať spoločne v rámci overeného protokolu, a nie považovať za nezávislé parametre, ktoré možno jednoducho zameniť.
Určité koncentrácie paraformaldehydu sa bežne používajú ako východiskové podmienky v publikovaných protokoloch fixácie kultivovaných buniek, ale žiadna jednotlivá koncentrácia by sa nemala považovať za univerzálny štandard. Vhodná koncentrácia a expozičný čas pre daný experiment závisia od konkrétneho typu vzorky, fixačnej teploty, následného testu a požiadaviek validovaného laboratórneho protokolu.
Teplota a kinetika
Teplota ovplyvňuje kinetiku fixácie a konzervačné charakteristiky. Podmienky izbovej teploty sa používajú v mnohých protokoloch, zatiaľ čo niektoré metódy používajú znížené teploty. Príslušné podmienky by sa mali riadiť validovaným protokolom pre vzorku a analýzu.
Požiadavky na následné aplikácie
Podmienky fixácie môžu rôznymi spôsobmi ovplyvniť rôzne následné testy. Rovnaký fixačný protokol, ktorý funguje dobre pre jednu aplikáciu, môže byť neoptimálny alebo dokonca nevhodný pre inú.
Imunofarbenie a imunofluorescencia
Fixácia môže ovplyvniť dostupnosť antigénu a rozsiahle zosieťovanie môže znížiť dostupnosť epitopu pre niektoré ciele. Pre aplikácie imunofarbenia sú fixačné podmienky typicky optimalizované tak, aby sa zachovala antigenicita a zároveň sa zabezpečilo, že väzbové miesta protilátky zostanú dostupné.
Prietoková cytometria
Podmienky fixácie pre prietokovú cytometriu závisia od cieľa, činidiel, stratégie permeabilizácie a overeného protokolu testu. Podmienky optimalizované pre mikroskopiu by sa nemali automaticky prenášať do pracovných postupov prietokovej cytometrie.
Fixácia môže tiež ovplyvniť enzymatickú aktivitu a iné molekulárne hodnoty, čím sa posilní potreba validácie špecifickej pre test.
Hodnotenie kvality fixácie
Kvalita fixácie by sa mala hodnotiť pomocou morfológie spolu s vykonaním zamýšľaného následného testu. Mikroskopické vyšetrenie môže poskytnúť užitočné predbežné informácie o tom, či bunky alebo tkanivá vyzerajú primerane zachované, ale samotný morfologický vzhľad nestačí na určenie, či je vzorka optimálne fixovaná.
Zmršťovanie, slabá štrukturálna definícia alebo iné morfologické zmeny môžu byť výsledkom viacerých faktorov vrátane podmienok fixácie, osmotických účinkov alebo artefaktov pri príprave vzorky. Naopak, morfologicky neporušené vzorky môžu stále fungovať zle v následných testoch, ak má fixácia zníženú antigenicitu alebo iné molekulárne vlastnosti.
Pre novú vzorku alebo test môžu byť podmienky fixácie overené experimentálne podľa zavedeného protokolu. Tento prístup umožňuje výskumníkom porovnávať výkon v celom rade podmienok fixácie a vybrať protokol, ktorý najlepšie podporuje ich špecifické následné požiadavky.
Manipulácia po fixácii vrátane premývania alebo ochladzovania tam, kde je to potrebné, by sa mala riadiť validovaným protokolom testu.
Úvahy o bezpečnosti a manipulácii
Paraformaldehyd a fixačné roztoky obsahujúce formaldehyd sú nebezpečné chemikálie. Expozícia formaldehydu je spojená s významnými zdravotnými rizikami vrátane podráždenia dýchacích ciest, senzibilizácie a potenciálnej karcinogenity.
Laboratórny personál pracujúci s paraformaldehydom alebo formaldehydovými fixačnými prostriedkami by mal:
- Prezrite si kartu bezpečnostných údajov (KBÚ) pre konkrétny používaný produkt
- Dodržiavajte inštitucionálne laboratórne postupy a príslušné požiadavky na bezpečnosť práce
- Pri príprave a manipulácii s fixačnými roztokmi používajte vhodné technické kontroly
- Noste vhodné osobné ochranné prostriedky podľa inštitucionálnych bezpečnostných protokolov
Prípravu a použitie paraformaldehydových fixatív by mal vykonávať len vyškolený personál v vhodne vybavených laboratórnych zariadeniach.
Čo by si mali nákupcovia laboratórií overiť
Pri hodnotení paraformaldehydového produktu na laboratórnu fixáciu by si kupujúci mali overiť nasledujúce informácie od dodávateľa:
- Presná trieda a špecifikácia produktu
- Čistota a príslušné informácie o nečistotách, ak sú špecifikované
- Vyhlásenie o zamýšľanom použití poskytnuté výrobcom
- Technický list (TDS)
- Karta bezpečnostných údajov (KBÚ)
- Certifikát analýzy (CoA) pre konkrétnu šaržu
- Informácie o skladovaní a trvanlivosti
- Použiteľné laboratórne alebo inštitucionálne protokolové požiadavky
Samotná chemická identita by sa nemala používať na odvodzovanie vhodnosti pre špecifické biologické laboratórne aplikácie. Vhodný stupeň a špecifikácia pre danú laboratórnu aplikáciu závisia od požiadaviek validovaného protokolu a zamýšľanej následnej analýzy.
Ak validovaný protokol vyžaduje špecializovanú triedu alebo špecifikáciu, kupujúci by mali potvrdiť, že dokumentácia k produktu preukazuje súlad s touto požiadavkou.
Záver
Neexistuje žiadny univerzálny čas fixácie paraformaldehydu, ktorý by sa vzťahoval na všetky bunky, tkanivá alebo testy. Podmienky fixácie sa musia zvoliť podľa charakteristík vzorky, formulácie fixačného prostriedku, teploty a požiadaviek následnej aplikácie.
Fixačný protokol, ktorý dobre funguje pre jednu aplikáciu, by sa nemal zovšeobecňovať na všetky typy buniek alebo experimentálne kontexty. Výskumníci by sa mali riadiť overenými protokolmi pre svoj špecifický typ vzorky a test a hodnotiť kvalitu fixácie pomocou morfologických kritérií a výkonu zamýšľanej následnej metódy.
Pre laboratórnych nákupcov musí byť vhodnosť produktu potvrdená na základe zdokumentovanej triedy, špecifikácie, informácií o čistote, dokumentácie zamýšľaného použitia a príslušných požiadaviek protokolu. Samotná chemická identita nestačí na stanovenie vhodnosti pre aplikáciu biologickej fixácie.
Pochopením faktorov, ktoré ovplyvňujú fixáciu paraformaldehydu, a dodržiavaním overených protokolov môžu výskumníci vybrať podmienky fixácie vhodné pre zamýšľané analytické ciele.
Referencie
- Hayat, MA (2000). *Princípy a techniky elektrónovej mikroskopie: Biologické aplikácie* (4. vydanie). Cambridge University Press.
- Suvarna, SK, Layton, C., & Bancroft, JD (2013). *Bancroftova teória a prax histologických techník* (7. vydanie). Churchill Livingstone/Elsevier.